Mengapa Laboratorium yang Berbeda Mendapatkan Hasil HPLC yang Berbeda? 5 Faktor yang Perlu Diperiksa

Anda melakukan prosedur HPLC yang sama di dua laboratorium terpisah dan hasilnya sangat berbeda. Hal ini terjadi lebih sering daripada yang Anda duga, dan bisa sangat menjengkelkan ketika Anda tidak tahu harus mulai mencari dari mana.

Hasil HPLC yang tidak konsisten dapat menunda peluncuran produk, memicu pengujian ulang, dan membahayakan pengajuan regulasi. Baik Anda sedang mengatasi masalah pemeriksaan kualitas normal atau transfer metode HPLC antar lokasi , mengetahui mengapa Anda mendapatkan hasil HPLC yang berbeda adalah langkah pertama dalam memperbaiki masalah tersebut. Panduan ini membahas lima penyebab paling umum, dan menawarkan strategi praktis untuk mempersempit akar penyebabnya.

1. Periksa Kondisi Sistem HPLC

Meskipun dua laboratorium menggunakan metode yang sama, instrumen itu sendiri mungkin tidak berkinerja identik. Sistem HPLC mengalami keausan seiring waktu, dan perbedaan kecil dalam kinerja perangkat keras dapat menyebabkan hasil bergeser dengan cara yang tidak langsung terlihat.

Beberapa hal yang perlu diperiksa pada setiap sistem:

• Kinerja pompa: Perubahan kecil pada laju aliran dapat memvariasikan waktu retensi dan memengaruhi daerah puncak. Segel pompa dan katup searah akan aus setelah jangka waktu tertentu dan mungkin perlu diganti secara berkala.
• Respons detektor: Penuaan lampu detektor, akurasi panjang gelombang, stabilitas garis dasar, dan kondisi detektor dapat memengaruhi respons sinyal dan harus diperiksa ketika hasilnya berbeda antar sistem. Dua detektor dengan model yang sama mungkin tidak merespons secara identik.
• Presisi injektor: Variabilitas autosampler merupakan sumber masalah reproduksibilitas HPLC yang sudah dikenal luas. Injektor yang memberikan volume yang sedikit tidak konsisten akan menghasilkan luas puncak yang tidak konsisten di setiap proses.
• Kontrol suhu: Jika oven kolom tidak mempertahankan suhu secara akurat, waktu retensi akan bergeser, terkadang terlihat jelas antara satu proses atau antara lokasi yang berbeda.

Sebelum menyimpulkan perbedaan tersebut disebabkan oleh metode itu sendiri, jalankan standar referensi yang sama pada kedua sistem dalam kondisi yang sama dan bandingkan parameter kesesuaian sistem yang relevan.

2. Pastikan Kolom-kolom Tersebut Benar-Benar Dapat Dibandingkan

Kolom merupakan salah satu parameter paling sensitif dalam HPLC dan salah satu area di mana perbedaan kecil sekalipun antar kolom dapat memengaruhi kinerja kromatografi, terutama jika kolom tersebut berbeda usia, lot, atau riwayat penggunaannya.

Faktor-faktor utama yang berkaitan dengan kolom yang dapat menyebabkan perbedaan hasil HPLC dirangkum dalam tabel berikut:

Faktor Kolom	Apa yang Mungkin Berbeda	Kemungkinan Pengaruh pada Hasil
Fase stasioner	Kimia atau sifat permukaan	Retensi dan selektivitas
Ukuran	Panjang, ID, ukuran partikel	Waktu retensi dan efisiensi
Usia kolom	Baru vs. bekas pakai	Bentuk puncak dan reproduksibilitas
Penyimpanan/pengkondisian	Riwayat penanganan yang berbeda	Retensi dan stabilitas garis dasar

Jika satu laboratorium menggunakan kolom yang baru dikemas dan laboratorium lain menggunakan kolom yang telah digunakan untuk beberapa ratus injeksi, perilaku kromatografinya dapat sangat berbeda. Selain itu, sebelum digunakan, kedua kolom harus dikondisikan dengan cara yang sama dan untuk jangka waktu yang sama.

3. Periksa Cara Pembuatan Fase Bergerak

Persiapan fase gerak adalah salah satu sumber variabilitas HPLC yang paling sering diabaikan. Resep tertulis yang sama dapat memberikan hasil yang sangat beragam tergantung pada bagaimana pelaksanaannya dalam praktik nyata.

Ketidakkonsistenan yang umum terjadi adalah kualitas pelarut (bahkan perbedaan kecil dalam tingkat pengotor dapat memengaruhi noise dasar), pH buffer (perbedaan 0.1 hingga 0.2 unit pH dapat menyebabkan pergeseran signifikan dalam retensi senyawa yang dapat terionisasi), dan praktik penghilangan gas (gas terlarut dapat menyebabkan kavitasi pompa dan ketidakstabilan garis dasar).  

Kualitas air juga penting, terutama untuk deteksi UV gelombang pendek. Perbedaan kontaminasi organik atau ionik dapat menyebabkan kebisingan latar belakang atau dasar yang lebih tinggi.

Standardisasi persiapan fase gerak di berbagai laboratorium, hingga ke urutan pencampuran dan waktu kesetimbangan, cenderung membuahkan hasil berupa reproduktivitas HPLC yang jauh lebih baik.

4. Membandingkan Langkah-langkah Persiapan Sampel

Jika teknik persiapan sampel tidak sama di setiap lokasi, perbedaan hasil mungkin mencerminkan proses persiapan dan bukan perbedaan komposisi sampel yang sebenarnya.

Sumber variasi yang umum adalah komposisi pengencer (bahkan ketidaksesuaian kecil dapat memengaruhi bentuk puncak atau kelarutan analit), prosedur pengenceran atau ekstraksi (waktu, suhu, dan pencampuran semuanya berpengaruh), dan langkah filtrasi, karena bahan filter yang berbeda dapat menyerap analit hingga tingkat yang berbeda. Pengaturan sentrifugasi pembersihan sampel juga dapat meninggalkan sejumlah partikel yang bervariasi, yang memengaruhi kinerja kolom dari waktu ke waktu.

Langkah pemecahan masalah yang paling cepat seringkali adalah menyiapkan sampel identik dari stok yang sama di kedua lokasi dan membandingkan kromatogram yang dihasilkan secara langsung.

5. Periksa Detail Metode Transfer

Transfer metode HPLC adalah proses di mana perbedaan kecil sekalipun dalam cara metode tersebut dijalankan dapat menyebabkan hasil yang berbeda. Menyatakan kondisi nominal secara eksplisit adalah sebuah metode, tetapi hal-hal praktis seperti cara sistem dipersiapkan, berapa lama kolom diimbangi, atau pengaturan parameter integrasi terkadang diabaikan dalam dokumen transfer.

Beberapa hal yang mudah terlewatkan:

• Parameter integrasi: Ambang batas awal dan akhir puncak, gaya koreksi garis dasar, dan batas area minimum semuanya dapat menghasilkan hasil kuantitatif yang berbeda dari data mentah yang sama.
• Volume tinggal gradien: Jika kedua sistem HPLC memiliki volume penahanan yang berbeda, metode gradien akan berperilaku berbeda kecuali hal ini diperhitungkan dan disesuaikan selama transfer.
• Pemrograman sekuens: Urutan proses, langkah pembilasan, dan injeksi pengkondisian antar sampel dapat bervariasi antar laboratorium dan memengaruhi seberapa stabil sistem selama suatu rangkaian.

Peninjauan cermat terhadap dokumentasi transfer metode dengan seseorang yang memiliki keahlian dalam menggunakan metode tersebut dalam praktik sering kali mengungkap kekurangan yang mungkin membutuhkan waktu berminggu-minggu untuk dipecahkan masalahnya jika dilakukan secara manual.

Bagaimana Menemukan Sumber Perbedaan

Biasanya, cara paling efisien untuk memulai ketika temuan HPLC berbeda dari satu laboratorium ke laboratorium lain adalah dengan perbandingan berdampingan. Jika Anda menjalankan standar referensi dan sampel yang identik di kedua lokasi dalam kondisi yang sangat terkontrol, lalu membandingkan temuan kesesuaian sistem, spesifikasi kolom, log fase gerak, dan kromatogram mentah, akan jauh lebih mudah untuk menentukan dari mana perbedaan itu berasal.

Sebaiknya mulai dari instrumen terlebih dahulu. Periksa kinerja sistem, kemudian kolom, lalu fase gerak dan persiapan sampel. Terakhir, evaluasi dokumentasi metode dan pengaturan integrasi. Pendekatan ini menghindari perubahan kolom atau penggantian reagen yang tidak perlu sebelum sumber variasi sebenarnya diidentifikasi.

Jaga Konsistensi Hasil HPLC Anda

Penyebab hasil HPLC yang tidak konsisten seringkali merupakan kombinasi dari perbedaan kecil di seluruh alur kerja, mulai dari kondisi instrumen dan riwayat kolom hingga fase gerak dan persiapan sampel. Orang sering meremehkan betapa pentingnya konsistensi dalam hal menyiapkan fase gerak, menangani kolom, menyiapkan sampel, dan mendokumentasikan metode.

Drawell menyediakan kromatografi cair kinerja tinggi Instrumen yang dirancang untuk aplikasi farmasi, lingkungan, keamanan pangan, dan penelitian yang secara konsisten berkinerja baik di berbagai lingkungan laboratorium. Kontak us dan pelajari cara menemukan sistem yang ideal untuk alur kerja Anda.